6.3 Идентификация клеток-реципиентов, содержащих рекомбинантные гены

Необходимо идентифицировать клетки, несущие ген-мишень. После трансплантации генов лишь небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии.

Первая стадия – поиск клеток, несущих вектор, например, по приобретенной способности быть устойчивыми к антибиотикам.

Вторая стадия – поиск клеток, несущих и вектор, и ген-мишень. Для этого используют две группы методов:

а) методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов:

– определение нуклеотидной последовательности ДНК, когда из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, затем проводят секвенирование;

– гибридизация выделенной ДНК с зондом, который может быть интересующим геном или соответствующей ему м-РНК;

б) методы, основанные на определении признака, кодируемого геном:

– непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени;

– использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень, например, клетки, несущие ген β-галактозидазы культивируют на среде с лактозой;

– иммунологическая детекция, например, при поиске в бактериях α-интерферона человека его связывают с антителами, то есть ген идентифицируют с помощью специфических антител к его белковому продукту.