3.6 Слияние протопластов или фузия клеток

Термин «протопласты» применяют для обозначения структур, которые образуются после полного удаления клеточной стенки у клеток растений, микроорганизмов, животных. Когда нет уверенности в том, что клеточная стенка целиком отсутствует, то говорят о «сферопластах» и о слиянии и трасформации сферопластов. Таким образом, сферопласты – это частичные протопласты.

Протопласты позволяют исследовать различные свойства мембран, транспорт веществ через плазмоллему.

Для получения протопластов используют несколько методов:

1) выращивание клеток на средах с антибиотиками, высокими концентрациями аминокислот. В результате нарушаются процессы биосинтеза клеточной стенки;

2) основной метод – ферментный лизис клеточной стенки, например, лизоцимом.

С помощью слияния протопластов можно получать генетические рекомбинанты у тех видов и штаммов микроорганизмов, у которых не обнаружены собственные системы обмена наследственной информацией и которые в естественных условиях никогда не скрещиваются между собой.

Следует подчеркнуть, что речь идет об объединении соматических (неполовых) клеток. В настоящее время методом фузии получают гибриды клеток человека и животных, млекопитающих и растений или дрожжей, хотя долгоживущих гибридов не получено. Фузия – универсальный метод для клеток любых микроорганизмов.

После разрушения клеточной стенки протопласты сшивают. Ранее для этого использовался вирус Сендай, в настоящее время используется водорастворимый полимер – полиэтиленгликоль. Протопласты сшиваются, в местах слипания мембран происходит разрыв, и содержимое двух соседних протопластов объединяется. Образующиеся структуры сохраняют способность к восстановлению клеточной стенки. В результате появляются гибридные клетки.

Однако слияния недостаточно для получения гибридных клеток, так как гибриды обладают меньшей способностью к росту и размножению, чем оставшиеся в культуре родительские клетки. Поэтому для получения культуры гибридных клеток используют специальные приемы. Чаще всего применяют селективные среды. Подбираются клетки, обладающие различными генетическими дефектами, и создаётся специальная среда для культивирования. На этой среде смогут расти только гибридные клетки, обладающие восполненными свойствами за счет обеих родительских клеток. Таким образом производят отбор гибридных клеток, то есть гибридная клетка содержит оба родительских хромосомных набора. Хромосомы обеих родительских клеток могут функционировать одновременно, при этом происходит дополнение (на языке генетики – комплементация) признаков.

Исследование гибридов позволяет установить, какая из хромосом ответственна за синтез того или иного белка. С помощью гибридных клеток, полученных слиянием клетки опухоли костного мозга мыши или крысы (так называемой миеломы) с иммунным лимфоцитом, синтезирующим определенные антитела, получают гибридомы. На гибридомах изучают механизмы клеточного размножения, с их помощью получают моноклональные антитела, используют в медицинской диагностике.