3.2 Мутагенез и методы выделения мутантов

В живой клетке одновременно синтезируется множество соединений. В норме обмен веществ в клетке осуществляется в экономичном режиме. Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма.

Сверхсинтез может быть осуществлен двумя путями:

1) путем спонтанного изменения генетической природы организма in vivo. Селекция (то есть направленный отбор) из природных высокопродуктивных штаммов может занимать годы;

2) путем индуцированного мутагенеза. Метод основан на использовании мутагенного действия ряда химических соединений (таких как гидроксиламин, нитрозамины, азотистая кислота, бромурацил, алкилирующие агенты и др), ультрафиолетовых и рентгеновских лучей. Мутагены вызывают замены оснований в составе ДНК, а также индуцируют мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания информации. Проводят тотальную проверку (скрининг) полученных клонов (клон – генетически однородное потомство одной клетки). Отбирают наиболее продуктивные.

В результате мутаций микроорганизма исчезает эффект катаболитной репрессии, а индуцибельные ферменты становятся конститутивными, то есть их экспрессия не зависит от присутствия в среде субстрата.

Е сли необходимо добиться накопления не конечного, а промежуточного продукта биосинтетического пути, то это может быть достигнуто с помощью мутанта, у которого блокирован этап синтеза:

Т акой мутант ауксотрофен, то есть растёт только при добавлении в среду вещества, служащего продуктом блокированной реакции:

О днако, возможны компенсирующие мутации, ведущие к активизации альтернативных путей синтеза недостающих соединений:

Тогда микроорганизмы не нуждаются в добавлении вещества Г и накапливают вещество Д в сверхколичествах.

На практике высокопродуктивные штаммы часто обладают двумя видами мутаций: в них ферменты становятся конститутивными, а они сами – ауксотрофными.