7.2 Методы и условия культивирования изолированных тканей и клеток растений

Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получило название метода культуры изолированных тканей.

Общие требования к выращиванию следующие:

– Асептика. Фрагменты ткани или органы растения – экспланты – могут быть ингибированы токсинами микроорганизмов, поэтому все операции должны проводиться в асептических условиях.

Для этого чистую посуду стерилизуют в автоклавах, питательную среду – в автоклавах или через бактериальные фильтры. Комнаты обрабатывают хлорамином, а затем ультрафиолетовыми лампами.

Сами растительные клетки могут быть источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация. Растение промывают водой с мылом, споласкивают чистой водой, затем промывают в растворах дезинфицирующих веществ (диацида сулемы, перекиси водорода) в течение от 1 до 40 мин. После выдерживания эксплантантов в дезинфицирующем растворе, их несколько раз промывают в дистиллированной воде и скальпелем удаляют наружный слой клеток на срезах эксплантантов, так как он мог быть поврежден стерилизацией.

– Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах. В состав сред входят макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы в концентрации от 2 до 3 % входят в состав любой питательной среды, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способно к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного света или в темноте.

В среды обязательно вводят ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. Добавление этих фитогормонов в различных соотношениях вызывает разные типы морфогенеза.

При приготовлении твердых питательных сред для поверхностного выращивания каллусных тканей используют агар-агар – полисахарид, получаемый из морских водорослей.

Универсальной является среда Мурасиге и Скуга, она пригодна для образования каллусов, поддержания неорганизованного каллусного роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений.