Техніка визначення

У дві пробірки заввишки 20 см і діаметром 2 см наливають по 5 мл субстрату і витримують при температурі 40 ºС в ультратермостаті протягом 10 хв для досягнення розчином зазначеної температури.

Потім у першу пробірку додають 2,5 мл дистильованої води (контроль), а в другу – 2,5 мл досліджуваного ферментного розчину (дослід). Пробірки ставлять у термостат з температурою 40 ºС на 1 год.

Після закінчення гідролізу в кожну пробірку додають по 5 мл 0,3 М розчину ТХО, щоб припинити ферментативну реакцію та осадити непрогідролізований казеїн. Суміш швидко перемішують і для більш повного осадження витримують 15 хв при температурі 40 ºС в термостаті. Потім розчини фільтрують через паперові фільтри і у фільтраті визначають кількість прогідролізованого білка за тирозином.

Для цього по 2 мл фільтрату наливають у широкі пробірки, повільно приливають у кожну по 5 мл 0,5М розчину вуглекислого натрію та по 1 мл робочого розчину реактиву Фоліна, безперервно перемішуючи, витримують в ультратермостаті при температурі 40 ºС для розвитку забарвлення 30 хв, а потім фотометрують на ФЕК з довжиною хвилі 656 – 677 нм при використанні кювет 5 мм. Оптичну густину розчинів вимірюють по відношенню до контрольної проби.

Розрахунок проводять за формулою, виведеною для визначення протеолітичної активності бактеріальних ферментних препаратів:

, од/г або од/мл,

де 4,7 і 0,1 – постійні коефіцієнти, отримані експериментально; D – оптична густина досліджуваного розчину; n – кількість ферментного препарату в 2 мл реакційної суміші, мг; 1000 – перерахунок на 1 г препарату.

Приклад розрахунку. На аналіз взято 0,1 г ферментного препарату, розчинено в 100 мл дистильованої води. Із цього розчину зроблено розведення – 5 мл до 100 мл, на протеоліз відібрано 2,5 мл. Після додавання ТХО об’єм реакційної суміші дорівнює 12,5 мл. На визначення тирозину взято 2 мл і отримано оптичну густину 0,193.

Кількість ферментного препарату в 2 мл фільтрату буде дорівнювати:

Реактиви

1. Розчин казеїну 1%-й. Для його приготування 2 г (порошку) і вносять у конічну колбу на 300 мл і приливають 140 мл карбонатно-гідрокарбонатного буфера рН 10,7. Колбу ставлять на магнітну мішалку і розчин перемішують протягом 30 хв. Потім, продовжуючи перемішування, колбу з субстратом вміщують у водяну баню з температурою 70 ºС до повного розчинення, охолоджують до 40 ºС і при цій температурі доводять рН до 10,5, додаючи 1 М розчин їдкого натрію.

Розчин казеїну кількісно переносять у мірну колбу на 200 мл і додають карбонатно-гідрокарбонатний буфер до об’єму 180 мл. Потім розчин казеїну охолоджують проточною водою до температури 20 ºС і об’єм субстрату доводять до 200 мл тим самим буфером. Розчин зберігають у холодильнику не більше 3 діб.

2. 0,2 М карбонатно-гідрокарбонатний буфер. Готують його змішуванням у мірній колбі на 200 мл розчин А – 45 мл, розчину Б – 5 мл, об’єм доводять до мітки дистильованою водою.

Розчин А – 0,2 М розчин карбонату натрію. Для його приготування розчиняють 21,2 г карбонату натрію в дистильованій воді, об’єм доводять до 1 л.

Розчин Б – 0,2 М розчин гідрокарбонату натрію. Для його приготування розчиняють 16,8 г гідрокарбонату натрію в дистильованій воді, об’єм доводять до 1 л.

3. 1 н. розчин їдкого натрію. Для його приготування 40 г їдкого натрію розчиняють у дистильованій воді, об’єм доводять до 1 л.

4, 5, 6 – 0,3 М розчин трихлороцтової кислоти (ТХО); 0,5 М розчин вуглекислого натрію та реактив Фоліна.

7. Робочий реактив Фоліна. Готують розведенням основного розчину безпосередньо перед аналізом у співвідношенні 1:3.

4.3. -галактозидаза

Лактоза – дисахарид, який складається з глюкози і галактози. Міститься в молоці і молокопродуктах (близько 4%).

Однією з важливих медичних проблем є корекція дефіциту лактази (-галактозидази) в організмі людини. Лактаза виробляється у верхньому відділі тонкого кишечнику і розщеплює лактазу на глюкозу і галактозу, які після цього легко всмоктуються у кров. Відсутність чи недостатність цього ферменту призводить до того, що хворі практично позбавлені можливості використовувати у своєму раціоні молоко і молочні продукти. Використання екзогенного ферменту лактази може вирішити цю проблему.

Визначення активності -галактозидази (лактази)

Метод ґрунтується на здатності ферменту -галактозидази каталізувати гідроліз лактози до глюкози і галактози. Глюкоза, що утворюється в процесі гідролізу, визначається специфічним глюкозооксидним методом.

За одиницю активності -галактозидази взято таку кількість ферменту, яка каталізує розщеплення 1 мікромоля лактози за 1 хв при температурі 30 ºС і оптимальному рН (оптимум рН для дріжджової -галактозидази дорівнює 6,9, а для грибної – 4,2).