logo
1butsenko_l_m_krasin_ko_v_o_tekhnologiyi_mikrobnogo_sintezu_l / Буценко Л

Лабораторна робота 6. Імобілізація ферментів методом сорбції

Іммобілізовані ферменти можуть бути використані для діагностики і лікування різних захворювань, а також для створення більш досконалих протезів і апаратів, що заміщають роботу важливих органів людини. Тому дослідження в галузі іммобілізації ферментів і клітин надзвичайно важливі й, очевидно, збережуть своє значення в найближчому майбутньому.

Іммобілізація ферменту це включення молекул ферменту до ізольованої фази, яка відокремлена від фази вільного розчину, але яка може обмінюватися з нею молекулами субстратів, продуктів, ефекторів або інгібіторів.

Іммобілізовані ферменти мають низку істотних переваг:

1) гетерогенний каталізатор (фермент) можна легко відокремити від реакційного середовища, що дає змогу зупинити в необхідний момент реакцію, застосувати його повторно та отримати чистий продукт, не забруднений ферментом;

  1. використання іммобілізованих каталізаторів робить можливим проведення ферментативного процесу безперервно, наприклад у проточному реакторі, і регулювання швидкості каталізованої реакції та виходу продукту зміною швидкості протоку;

  2. іммобілізація ферментів дає можливість регулювати їх каталітичну активність, змінюючи властивості носія під впливом деяких фізичних чинників, таких як світло, звук, тощо;

  3. імобілізація та/чи модифікація ферментів полегшує цілеспрямовану зміну властивостей каталізатора, включаючи специфічність, залежність каталітичної активності від рН, іонного складу та інших параметрів середовища.

Методи іммобілізації:

адсорбція ферментів на нерозчинних носіях;

іммобілізація ферментів шляхом включення в гель;

іммобілізація ферментів в напівпроникні структури (мікрокапсулювання та включення ферментів в ліпосоми);

іммобілізація шляхом утворення ковалентного зв’язку між ферментом та носієм.

Найбільш простий метод іммобілізації ферментів - це адсорбція на нерозчинному носії. Процедура іммобілізації полягає у змішуванні за певних умов ферменту та носія, інкубації та відокремленні нерозчинного компоненту суміші від розчинного центрифугуванням або фільтруванням. Головним недоліком цього методу є те, що фермент може зв'язуватися з носієм недостатньо міцно. Наприклад, оскільки адсорбція ферментів на такому носії, як ДЕАЕ-сефадекс, здійснюється переважно за рахунок множинних сольових зв'язків, на такого роду зв'язки впливають навіть незначні зміни експериментальних умов: рН, іонної сили, температури та природи розчинника, – що може призвести до десорбції ферменту з носія. Десорбцію ферменту може викликати також субстрат. Крім сольових зв'язків у взаємодії ферменту з носієм можуть брати участь і інші слабкі сили, наприклад водневі чи Ван-дер-вальсові.

Матеріали, які використовуються для адсорбції ферментів: оксид алюмінію, бентоніт, карбонат кальцію, гель фосфату кальцію, вугілля, целюлоза, глина, колаген, конканавалін А-сефароза, пористе скло, гідроксиапатит, іонообмінні смоли, каолін, фенольні полімери, силікагель.

У ідеальному випадку іммобілізація ферментів не повинна призводити до втрати каталітичної активності. Активність іммобілізованих ферментів можна визначати практично всіма відомими методами. При аналізі іммобілізованих ферментних препаратів необхідно постійно перемішувати реакційну суміш, тому що можливе осідання частинок носія і зменшення активності. Для зупинки ферментативної реакції при аналізі можна використовувати відділення ферменту від реакційної суміші фільтруванням або центрифугуванням.

Завдання для виконання студентами.

1. Приготувати розчини амілолітичного або протеолітичного ферментів 1% концентрації.

2. Очистити розчин від сторонніх домішок (фільтруванням або центрифугуванням).

3. Визначити активність ферменту (методи див. вище).

4. Наважку носія (силікагель) 1 г залити 20 мл розчину ферменту.

5. Витримати суміш 30-60 хв при кімнатній температурі періодично перемішуючи.

6. Відділити носій від ферментного розчину фільтруванням через паперові фільтри та промити його дистильованою водою (100 мл).

7. Висушити носій з ферментом за температури 40 С.

8. Визначити активність імобілізованого ферменту.

Під час визначення активності замість розчину ферменту вносити в реакційну суміш 50-100 мг імобілізованого ферментного препарату і дистильовану воду в об’ємі рівному об’єму ферментного розчину за методикою.

9. Розрахувати вихід активності при імобілізації:

В = Аімоб./Авих.*100%, де

А – загальна кількість одиниць активності ферменту на носії, А – загальна кількість одиниць активності ферменту в розчині, що використовувався для імобілізації.

10. Результати роботи звести у таблицю:

Назва ферментного препарату

Активність нативного препарату

Активність імобілізованого препарату

Вихід ферменту при імобілізації

Контрольні запитання.

  1. Назвіть переваги іммобілізованих ферментів.

  2. Охарактеризуйте носії для іммобілізації ферментів.

  3. Які методи використовують для іммобілізації ферментів?

  4. Які особливості визначення активності іммобілізованих ферментів?

  5. Наведіть приклади використання іммобілізованих ферментних препаратів в медицині.

  6. Які методи дозволяють уникнути втрат ферменту під час іммобілізації?

  7. Як може змінюватися активність ферменту при іммобілізації?

  8. Які недоліки іммобілізації ферментів сорбцією на твердому носії?