5.1 Поверхневий спосiб культивування продуцентiв ферментiв (закінчення).

Екстрагування ферментів з поверхневих культур

Після того як культивування закінчено, культуру підсушують і з кювет вона надходить до загального бункера, з якого поступає на подрібнення. Після цього культура надходить на стадію екстракції ферменту.

Всі ферменти є водорозчинними білками, тому найкращим екстрагентом для них є вода. Для видалення ферментів з дріжджових та бактеріальних клітин їх необхідно зруйнувати використовуючи механічні, хімічні або біологічні методи, оскільки їхні клітинні стінки мають високий дифузійний опір. Оболонки міцеліальних клітин мають низький дифузійний опір, тому дезінтеграція клітин грибів непотрібна.

На повноту екстрагування ферментів впливають багато факторів: температура, рН, тривалість процесу, конструктивні особливості екстракційних апаратів.

Серед небажаних процесів, що можуть відбуватися після дезінтеграції клітин, – протеоліз власними клітинними протеазами цільового ферменту. Цей процес може відбуватися навіть при підтриманні низької температури, особливо при очищенні ферменту, оскільки після видалення супутніх білків фермент стає єдиним субстратом протеази. Інактивацію протеаз здійснюють обробкою клітинного екстракту специфічними інгібіторами-комплексонами (ЕДТА, о-фенантролін, оксихінолін), солями ртуті або срібла. Протеази можуть бути видалені також сорбцією на афінних сорбентах. Якщо протеази термолабільні, а цільовий фермент термостабільний, їх можна денатурувати нагріванням клітинних екстрактів.

Денатурацію нуклеїнових кислот в процесі очищення ферментів обумовлює низька іонна сила чи основність середовища. Можна використати спеціальні осадники, що утворюють з нуклеїновими кислотами нерозчинні комплекси. З цією метою використовують бромистий цетилтриметиламмоній, стрептоміцин сульфат, протаміносульфат, поліетиленімін. Інший метод видалення нуклеїнових кислот використання нуклеаз – панкреатичних ДНК-аз та РНК-аз.