8.2 Біотехнологія отримання рибофлавіну (закінчення).

У ході ферментації Eremothecium ashbyii упродовж перших 30-40 год майже повністю розходуються вуглеводи, після чого відзначається інтенсивний біосинтез рибофлавіну з накопиченням його у культуральній рідині. Накопичення рибофлавіну у культуральній рідині співпвдвє за часом з початком автолізу культури. У глибинній культурі Eremothecium ashbyii вміст рибофлавіну упродовж перших двох діб приблизно однаковий як у міцелії, так і в культуральній рідині. Починаючи з третьої доби, переважна кількість рибофлавіну знаходиться у культуральній рідині, а вміст його у міцелії різко падає.

Слід відмітити, що рибофлавін присутній у культуральній рідині у вільній формі. У клітинах Eremothecium ashbyii він зустрічається у вигляді флавінаденіндинуклеотиду і вільного вітаміну, розташованого у вигляді жовтих кристалів у вакуолях.

Одержання технічного кристалічного рибофлавіну. Для одержання кристалічного РФ культуральну рідину, одержану після культивування E. аshbyii, нагрівають до температури 95–100 °С. За таких умов весь рибофлавін виходить з клітин. Далі здійснюють центрифугування розчину, одержаний супернатант охолоджують до 18–20 °С, доводять рН до 4,5–5,0 і осаджують рибофлавін з розчину за допомогою гідросульфіту. Після декантації осад промивають, центрифугують, висушують і подрібнюють.

Визначення процентнтного вмісту в кристалічному препараті

Точну наважку препарату в кількості 0,01 г переносять у мірну колбу ємністю 250 мл, розчиняють у воді при нагріванні і доводять водою до мітки. З отриманого розчину відбирають 1 мл в мірну колбу ємністкою 100 мл і доводять водою до мітки. У к’ювету флуорометра переносять 10 мл отриманого розчину і вимірюють інтенсивність його флуоресценції у порівнянні зі стандартним розчином.

Вміст рибофлавіну у відсотках у продукті (х) обчислюють за формулою:

де А₁ - показання флуорометра для дослідного розчину;

250 - перше розведення в мл;

100 - друге розведення в мл;

0,4 - концентрація стандарту в γ;

100 - перерахунок у%;

А - показники флуорометра для стандартного розчину;

0,01 - наважка у г;

1 - кількість розчину, взята для другого розведення, в мл;

1000 - перерахунок у мг;

1000 - перерахунок у г.

Визначення процентнтного вмісту в технічному продукті

Зразки рибофлавіну можуть бути забруднені флуоресцентними домішками. Обробкою гідросульфітом натрію рибофлавін відновлюють у лейкофлавін, який втрачає здатність до флуоресценсії, тоді як домішки не відновлюються. По різниці в інтенсивності флуоресценції оброблених і необроблених гідросульфітом розчинів судять про кількість рибофлавіну.

Точну наважку випробуваного продукту в кількості 0,01 г переносять у мірну колбу ємністю 250 мл, розтворюють у воді і доводять водою до мітки. Якщо отриманий отриманий розчин має інтенсивну флуоресценцію, проводять друге розведення. Для цього відбирають 1 мл розчинити у мірну колбу ємністю 100 мл і доводять об'єм розчину до мітки водою. З отриманого розчину відбирають дві проби:

а) 8 мл розчину переносять в кювету для вимірювання флуоресценції і доводять водою до 10 мл. Вміст цієї кювети надходить безпосередньо на вимірювання інтенсивності флуоресценції;

б) 8 мл переносять у конічну колбу ємністю 50-100 мл, туди ж по краплях додають 4% розчин перманганату калію до появи незникаючого розового забарвлення. Після цього вміст колби залишають на 10 хвилин і потім надлишок внесеного перманганату видаляють, додаючи по краплях 3% розчин Н₂О₂. До вмісту колби додають 0,2 мл розчину хлористого олова і 0,1 мл розчину гідросульфіту натрія, після чого вміст колби енергійно струшують протягом 20 хвилин, а потім кількісно переносять у мірну колбу чи точно градуйований циліндр і доводять водою до обсягу 10 мл. Отриманий розчин фільтрують в к’ювету флуорометра.

Вміст обох кювет надходить на вимірювання флуоресценції.

Примітка. Якщо при окисленні перманганатом розчин у другій колбі від додавання 1 краплі перманганату забарвлюється в рожевий колір, що заважає вимірюванню флуоресценції домішок у дослідному розчині не міститься, тоді при розрахунку приймають до уваги показання флуорометра для першої кювети, вміст, якої не піддавалося окисненню.

Вміст рибофлавіну у відсотках (х) обчислюють за формулою:

де 100 - друге розведення в мл;

10 - третє розведення в мл;

0,01- наважка у г;

8 - кількість розчину, взята на окислення, в мл;

Інші позначення див. вище.

Визначнння в драже і таблетках

Близько 1 г порошку розтертих драже або таблеток (точна наважка) розчиняють при нагріванні у воді, переносять у мірну колбу ємністю 250 мл, охолоджують, доводять до мітки водою і фільтрують. З фільтрату відбирають 5 мл у мірну колбу ємністю 250 мл, доводять об'єм до мітки водою і перемішують. У дві кювети флуорометра переносять 8-10 мл випробуваного і стандартного робочого розчину для вимірювання флуоресценції. Одночасно в інші дві кювети переносять 8-10 мл випробуваного і стандартного робочого розчину, додають близько 0,1 г бікарбонату натрію і гідросульфіту натрію для гасіння флуоресценції рібофлавіну як у звичайному, так і у випробуваному розчині, де залишається флуоресценція тільки сторонніх флуоресціюючих речовин.

Результат вимірювання порівнюють з показанням флуорометра для стандартного робочого розчину рибофлавіну.

Вміст рибофлавіну в 1 шт. драже або таблеток у міліграмах (х) обчислюють за формулою:

де А - показання флуорометра для випробуваного розчину;

В - показання флуорометра для випробуваного розчину після гасіння;

А₁ - показання флуорометра для робочого стандартного розчину;

В₂ - показання флуорометра для стандартного розчину після гасіння;

0,4 - концентрація стандартного розчину рибофлавіну в γ;

А - наважка у г;

V - об'єм, в якому розчинена наважка, в мл;

V₁ - об'єм, взятий для розведення в мл;

V₂ - об'єм, взятий після розведення, в мл;

d - середня вага однієї  таблеток чи драже у г;

а - наважка у г;

1000 - перерахунок у мг.

Завдання для виконання студентами.