Чутливість мікроорганізмів до дії антибіотиків

Вивчення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків здійснюються для вирішення низки завдань:

- обґрунтування цілеспрямованої індивідуальної антибактеріальної терапії для лікування конкретної інфекційної хвороби;

- обґрунтування емпіричної терапії окремих нозологічних форм інфекційних хвороб в межах лікувальних установ або регіонів;

- спостереження за розповсюдженням антибіотикорезистентності в окремих установах або регіонах;

- дослідження нових хімічних сполук на наявність антибактеріальної активності.

Дослідженню на чутливість до антибіотиків підлягають чисті культури мікроорганізмів або ізольовані колонії із щільних поживних середовищ первинного посіву клінічного матеріалу. Визначення чутливості з використанням клінічного матеріалу (без виділення чистої культури) можливо тільки у виключних випадках за умови підтвердження однорідності культури і високого ступеня обсіменіння при мікроскопії мазків забарвлених за Грамом. При такій ситуації дослідження слід повторити після виділення чистої культури мікроорганізму.

Серед стандартизованих методів визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків розрізняють методи серійних розведень та дифузійні. Крім того, в даний час все більш широкого розповсюдження набувають автоматичні методи.

Методи серійних розведень базуються на прямому визначенні мінімальної інгібуючої (подавляючої) концентрації (МІК) препарату, що характеризує мікробіологічну активність антибіотика.

МІК - мінімальна концентрація препарату, яка пригнічує видимий ріст досліджуваного мікроорганізму в бульйонній культурі або на щільному поживному середовищі.

Для визначення величини МІК певні концентрації антибіотика вносять у поживне середовище, яке потім засівають культурою досліджуваного мікроорганізму і після інкубації оцінюють наявність або відсутність видимого росту.

Розрізняють методи серійних розведень в агарі або в бульйоні. В залежності від об'єму використаного бульйону, розрізняють методи серійних макро- і мікророзведень. В автоматизованих системах для визначення чутливості мікроорганізмів використовується метод, заснований на використанні тільки двох концентрацій антибіотика, які відповідають граничним значенням МІК.

В основу дифузійних методів визначення чутливості покладена дифузія антибіотика із носія у щільне поживне середовище до концентрації препарату, яка перевищує МІК, і пригнічує ріст досліджуваної культури в цій зоні. Існують дві основні модифікації дифузійного методу: диско-дифузійний та Е-тест.

В диско-дифузійному методі у якості носія антибіотика використовують паперовий диск (Табл.1.2). Утворення зони пригнічення росту відбувається в результаті дифузії антибіотика з носія в поживне середовище. Диско-дифузійний метод дозволяє лише опосередковано зробити висновок про величину МІК, а результатом дослідження є віднесення мікроорганізму до однієї з категорій чутливості (чутливий, помірно-стійкий або резистентний).

Мікроорганізм є чутливим до даного антибіотика в тому випадку, коли у нього немає механізмів резистентності до антибіотика і при лікуванні стандартними дозами антибіотика інфекцій, викликаних цим мікроорганізмом, відмічається добра терапевтична ефективність.

Мікроорганізм вважають помірно резистентним, якщо пригнічення його росту відбувається лише за використання великих доз антибіотика. При лікуванні хвороб, спричинених таким мікроорганізмом добра терапевтична ефективність спостерігається лише за використання високих терапевтичних доз антибіотика та при локалізації інфекції в місцях, де антибіотик накопичується у високих концентраціях.

Мікроорганізм вважається резистентним до даного антибіотика , якщо він має механізми стійкості до останнього та його ріст не пригнічують навіть дуже великі дози антибіотика. При лікуванні захворювань спричинених таким мікроорганізмом не відмічають терапевтичного ефекту навіть при використанні максимальних терапевтичних доз антибіотика.

Таблиця 1.2.

Вміст антибіотиків у стандартних дисках для визначення

чутливості мікроорганізмів

Назва	Кількість в диску	Назва	Кількість в диску
Ампіцилін	10 мкг	Ріфампіцин	5 мкг
Гентаміцин	10 мкг	Стрептоміцин	30 мкг
Ерітроміцин	15 мкг	Тетрациклін	30 мкг
Канаміцин	30 мкг	Фурадонін	300 мкг
Левоміцетин	30 мкг	Фуразолідон	300 мкг
Лінкоміцин	15 мкг	Цефазолін	30 мкг
Оксациллін	10 мкг	Цефотаксим	30 мкг
Олеандоміцин	15 мкг	Цефтриаксон	30 мкг
Пеніцилін	10 ОД	Цефуроксим	30 мкг
Поліміксин	300 ОД

Е-тест - це вузька полімерна смужка (0,5 x 6,0 см), на яку нанесений градієнт концентрацій антибіотика (від мінімальних до максимальних). Пригнічення росту мікроорганізму навкруги смужки Е-тесту відбувається тільки в тій зоні, де концентрація антибіотика, що дифундує з носія, вище МІК, при цьому утворюється краплеподібна зона інгібування (рис.1. 2.).

Значення концентрацій антибіотика на кожній ділянці носія нанесені на зовнішній (зверненій до дослідника) поверхні Е-теста. Величину МІК враховують в тому місці, де межа зони пригнічення росту впритул підходить до носія. Детальні інструкції про визначення чутливості з використанням Е-тестів додаються виробником до набору.

Рис.1. 2. Е-тест для визначення чутливості мікроорганізмів до дії антибіотиків

Основні етапи проведення тестування. Для вивчення антибіотикочутливості мікроорганізму, незалежно від методу дослідження, необхідно послідовно виконати такі етапи:

- приготувати поживні середовища;

- приготувати суспензії досліджуваних мікроорганізмів (інокулюма);

- внести інокулюм в поживне середовище;

- інкубувати посіви визначений проміжок часу при відповідних температурних параметрах;

- облік результатів та їх інтерпретація, формулювання рекомендацій щодо лікування.

Дифузійні методи включають також етап накладення дисків або смужок Е-тесту на щільне поживне середовище.

Диско-дифузійний метод (ДДМ). Метод оснований на здатності антибіотиків дифундувати з просочених ними паперових дисків в поживне середовище і пригнічувати ріст мікроорганізмів посіяних на поверхні агару.

Щільне поживне середовище розливають у чашки Петрі шаром товщиною 4,0 +- 0,5 мм, попередньо виставивши їх на горизонтальну поверхню (вивірену рівнем, без западин і опуклостей). Це вкрай важливо, оскільки розмір і форма зони пригнічення росту залежать від глибини і рівномірності агарового шару. Чашки залишають при кімнатній температурі для застигання. Зберігати чашки можна запаяними в поліетиленові пакети при 4-8С протягом 5 діб. Перед інокуляцією чашки підсушують у термостаті при 35С з привідкритою кришкою протягом 10-20 хв. Конденсату рідини на внутрішній поверхні кришок не повинно бути.

Для визначення чутливості використовують тільки стандартизовані якісні диски з антибіотиками. Виготовлення дисків з антибіотиками для визначення чутливості диско-дифузійним методом в лабораторних умовах не допускається.

Достовірність результатів дослідження залежить також від умов зберігання готових комерційних дисків, оскільки вміст в них антибіотиків може знизитися нижче допустимого рівня до закінчення терміну придатності. Зберігати диски з антибіотиками тривалий термін слід в герметичній упаковці в морозильній камері при температурі -18 С і нижче. Невеликі партії дисків, що використовуються в повсякденній роботі, можна тримати в холодильнику при температурі 4-8 С, щільно закупореними, щоб гарантувати неможливість попадання у флакон вологи, крім того, для додаткового захисту від вологи флакони (картриджі) з дисками комерційного виготовлення містять спеціальний вологопоглинач (силікагель). Флакони (картриджі) з дисками слід витримувати перед використанням герметично закритими до досягнення ними кімнатної температури протягом 1 години, що запобігає утворенню конденсату на дисках після відкривання флаконів.

При визначенні чутливості ДДМ використовують стандартний інокулюм, що містить 1,5 х 10⁸ КУО/мл. Інокулюм слід використовувати протягом 15 хвилин з моменту приготування.

На поверхню поживного середовища наносять диски з антибіотиками. Аплікацію дисків проводять за допомогою стерильного пінцета або автоматичного диспенсора. Відстань від диска до краю чашки і між дисками повинна бути 15-20 мм, тобто на одну чашку діаметром 100 мм слід поміщати не більше 6 дисків з антибіотиками. Диски повинні рівномірно контактувати з поверхнею агару, для чого їх слід акуратно притиснути пінцетом.

Відразу після аплікації дисків чашки Петрі поміщають в термостат догори дном і інкубують при температурі 35 С протягом 18-24 год. (в залежності від виду досліджуваного мікроорганізму). Збільшення інтервалу часу між нанесенням дисків на поверхню середовища і початком інкубації, а отже і початком росту досліджуваної культури, приводить до "переддифузії антибіотика" в агар і до збільшення діаметра зони пригнічення росту.

Завдання для виконання студентами.

Фізико-хімічні методи визначення кількості антибіотиків

1. Визначити вміст пеніцилінів у запропонованих препаратах або розчинах.

2. Визначити вміст хлортетрацикліну у запропонованих препаратах.

3. Отримані результати занести до таблиці (табл. 1.3 ) та проаналізувати.

Таблиця 1.3

Результати визначення вмісту антибіотика в препаратах

Біологічні методи визначення кількості антибіотиків (початок)

1. Приготувати суспензію клітин тест-штаму (B. subtilis).

2. Засіяти поживне середовище суспензією клітин тест-штаму.

3. Встановити з дотриманням умов стерильності циліндри (по 4 шт. на чашку) або зробити лунки в поживному середовищі.

4. Внести в циліндри по 0,1 мл розчинів антибіотика (стрептоміцина) з відомою (3 циліндри) та невідомою концентрацією.

5. Встановити чашки на вирощування (температура 37ºС, 18 – 24 год).

Визначення чутливості мікроорганізмів до дії антибіотиків (початок)

1. Приготувати суспензії клітин бактерій B.subtilis, B.mesentericus, E.aroidea, M. luteus, дріжджів S. cerevisiae, R. glutinis, грибів A. niger, A.awamori, P. chrysogenum, A. orizae, A. foetidus, R. nigricans.

2. Засіяти поживні середовища суспензією клітин мікроорганізмів.

3. Розкласти на середовища диски, що містять антибіотики враховуючи спектр дії антибіотика (не більше 5 дисків на чашку).

4. Встановити чашки на вирощування (температура 37ºС, 18 – 24 год).

Контрольні запитання.

1. В яких одиницях визначають кількість антибіотиків?

2. Принцип методу визначення кількості пеніцилінів.

3. Принцип методу визначення хлортетрацикліну.

4. Назвіть переваги та недоліки біологічних методів визначення кількості антибіотиків.

5. Вимоги до тест-культур, що використовують для визначення кількості антибіотиків.

6. Які тест-культури використовують для визначення кількості пеніциліну стрептоміцину цефалоспорину.

7. Що таке набута резистентність мікроорганізмів до антибіотиків?

8. Охарактеризуйте методи, що дозволяють визначати стійкість мікроорганізмів до антибіотиків.

9. Які причини набуття стійкості?

10. Які заходи подолання стійкості до антибіотиків?

Лабораторна робота 2.

Біологічні методи визначення кількості антибіотиків (закінчення).

Визначення чутливості мікроорганізмів до дії антибіотиків (закінчення).

Біотехнологія отримання хлортетрацикліну (початок).

Розрахунок кількості антибіотика при аналізі розчину методом дифузії.

Біологічну активність антибіотиків розраховують за допомогою стандартної кривої. Для побудови стандартної кривої використовують п`ять концентрацій стандартного препарату. Одна з концентрацій, за якою вносять поправки для всіх інших концентрацій, є контрольною. Застосовувані для побудови кривої концентрації не повинні відрізнятися від контрольної концентрації більш як на 40 або 50 %. Для кожної концентрації, крім контрольної, використовують три чашки. У три циліндри або лунки кожної чашки вносять розчин контрольної концентрації, у три інші – одну з узятих концентрацій стандарту. Після вимірювання зон затримання росту для кожної концентрації виводять середній розмір зони з трьох чашок, потім виводять середній розмір зони для контрольної концентрації з усіх чашок (36 зон).

За різницею між середнім розміром зони контрольної концентрації, виведеної з усіх чашок, і середнім розміром зони контрольної концентрації, виведеної з трьох чашок із кожною окремою концентрацією, визначають поправку до розміру зони даної концентрації. Знайдену поправку додають до середнього розміру зони даної концентрації, якщо вона позитивна, і віднімають, якщо вона негативна.

Приклад 1. Середній розмір зони для контрольної концентрації 1 од/мл, виведений із 36 зон, дорівнює 19,2 мм. Середній розмір зони для тієї самої концентрації, виведений із трьох чашок, на яких випробовувався розчин із концентрацією 0,8 од/мл, дорівнює 19 мм. Отже, розмір поправки буде +0,2 мм. Середній розмір зони для концентрації 0,8 од/мл дорівнює 17,9 мм; збільшуючи поправку +0,2, одержують розмір 18,1 мм. Таким самим способом виправляють значення розміру зони для всіх концентрацій.

За виправленими значеннями розмірів зон узятих концентрацій і середнім розміром зони контрольної концентрації з усіх чашок будують стандартну криву за напівлогарифмічною сіткою розрахунку активності антибіотиків, відкладаючи на осі абсцис величини зон проти показань відповідних концентрацій на осі ординат. Якщо умови досліду залишаються постійними, то стандартною кривою можна користуватися протягом тривалого часу, час від часу повторюючи кут нахилу кривої за двома концентраціями на трьох-п`яти чашках. Для визначення активності препарату готують одне розведення з концентрацією, близькою до контрольної концентрації стандарту. Для кожного випробування готують не менше п’яти чашок. У три циліндри кожної чашки або лунки вносять випробуваний розчин досліджуваного препарату, а в три інші – контрольну концентрацію стандартного препарату.

Після інкубації заміряють зони пригноблення, утворені контрольною концентрацією стандарту і випробуваного розчину препарату. Знаходять середнє значення розмірів зон із трьох чашок. Різницю між знайденими середніми розмірами зон випробуваного розчину препарату і контрольною концентрацією додають до значення розміру зони контрольної концентрації на кривій. Потім за кривою знаходять концентрацію, що відповідає знайденій величині зон (од/мл). Множенням отриманої концентрації на ступінь розведення одержують вміст од (активність) у 1 см³ основного розчину або в 1 мг препарату.

Приклад 2. Середній розмір зони для випробуваного препарату стрептоміцину сульфату при розведенні 1:300  18,6 мм, середній розмір зон для 2 од/мл стандартної кривої, що відповідає 18,2 мм, дорівнює 18,8 мм. Знаходять на кривій концентрацію, що відповідає даному розміру зони 2,36 од. Цей розмір множать на ступінь розведення й одержують вміст од у 1 мл основного або в 1 мг випробуваного препарату, тобто 2,36 од х 300 = 708 од/мг.

Біотехнологія отримання хлортетрацікліну.

Тетрацикліни зберігають до сьогодні важливе значення при лікуванні захворювань дихальних шляхів, спричинених хламідіями, рикетсіями, спірохетами, мікоплазмами, що є стійкими до інших антибіотиків. Крім цього, деякі тетрациклінові антибіотики використовуються в сільському господарстві.

Хлортетрациклін (біоміцин) належить до антибіотиків тетрациклінового ряду і має наступну будову:

Вперше було виділено у 1948 році Б.Дуггаром і названо ауреоміцином. Продуцент Streptomyces aureofaciens. Після вивчення хімічної будови дано назву хлортетрациклін (ХТЦ). Випускається промисловістю під назвами біоміцин, ауреоміцин, дуоміцин, біовіт.

S. aureofaciens – аероб, оптимальна температура розвитку 26–28ºС, крім хлортетрацикліну накопичує вітамін В₁₂, тетрациклін і інші антибіотичні речовини.

ХТЦ має найбільшу активність при рН 3,5–4, в лужному середовищі досить швидко руйнується. Дія ХТЦ бактеріостатична. ХТЦ застосовується тільки як антибіотик для ветеринарії, бо, незважаючи на його активність проти коклюшу і дифтерії, він є високотоксичним препаратом.

Культура S. aureofaciens в якості джерела вуглецю використовує крохмаль, декстрини, мальтозу, фруктозу, не засвоює лактозу, цукрозу, арабінозу. Найбільш ефективне джерело вуглецю – глюкоза.

Компонентами комплексного середовища для одержання ХТЦ є крохмаль, соєве борошно, кукурудзяне борошно. Альтернативне джерело вуглецю – оцтова, молочна, янтарна кислоти або багатоатомні спирти – манніт, сорбіт, гліцерин, тваринні і рослинні жири. Тваринні і рослинні жири одночасно є піногасниками.

Амонійні солі при біосинтезі ХТЦ можуть бути єдиним джерелом азоту. Культура має досить розвинений протеолітичний комплекс і тому може засвоювати органічні джерела азоту – поліпептиди, амінокислоти. Найбільш ефективний варіант – присутність в середовищі як органічного, так і неорганічного азоту.

Як джерело фосфору використовують кукурудзяний екстракт. На синтетичних середовищах використовують фосфорнокислі солі.

Біосинтезу ХТЦ сприяє молочна кислота, джерелом якої є кукурудзяний екстракт. Метали – магній, залізо, цинк, мідь додають в синтетичні середовища у вигляді солей, в комплексні середовища ці елементи не додають.

Негативно впливає на біосинтез тетрацикліну надлишок неорганічного фосфору в середовищі, при цьому прискорюються ріст продуцента, споживання вуглеводів, відбувається накопичення піровиноградної і оцтової кислот і зменшується антибіотична активність.

Середовище для культивування має рН 6,6–7,2. Процес біосинтезу ХТЦ відбувається при рН 5,5–7,2 температурі 27–28ºС. Необхідною є посилена аерація в порівнянні з іншими випадками, а припинення аерації навіть на незначний термін призводить до припинення біосинтезу.

Після ферментації відбувається відділення міцеліальної маси, яку потім знімають з фільтрів і висушують на парових сушарках. Іншим способом культуральну рідину без фільтрації висушують на розпилюючій сушарці. Більша частина ХТЦ знаходиться в міцелії. ХТЦ, який знаходиться в культуральній рідині, можна осадити при простому підкисленні при рН 7,5-8,0. Товарний препарат одержують висушуванням вологого осаду, який надходить з фільтрпресів.

ХТЦ витримує температуру 100ºС, тому для його отримання в сухому вигляді сушіння триває 3,5-4 години і значення кінцевої вологості препарату 6%. Сушильним агентом є повітря (40-50ºС в стрічкових сушарках, в розпилювальній сушарці температура до 200ºС).

Для сільського господарства випускається препарат «Біовіт».

Загальний вигляд – однорідний порошок коричневого кольору зі специфічним запахом нерозчинний у воді. В 1 г препарату «Біовіт – 120» міститься 120 мг ХТЦ та не менше ніж 120 г вітаміну В₁₂. В 1 г «Біовіт – 80» - 80 мгХТЦ та не менше ніж 8 мкг В₁₂. «Біовіт – 40» - 40 мг ХТЦ та не менше 40 мкг В₁₂.

Для промислового культивування S. aureofaciens використовується середовище такого складу, %:

Кукурудзяне борошно	4
NH4NO3	0,7
CaCO3	0,4
NaCl	0,3
Кукурудзяний екстракт	0,3

Вихідне рН середовища 6,6, тривалість ферментації – 60 – 72 год. Перед посівом у середовище стерильно добавляють роданистий бензил (0,0001 % до об'єму середовища), розчинений у стерильній олії, що є стимулятором утворення ХТЦ.

Посівний матеріал для виробництва хлортетрацикліну готують на спеціальних посівних станціях, де продуцент S. aureofaciens вирощують на розпареному пшоні в спеціальних флаконах до утворення великої кількості спор. Запарафіновані флакони з паспортом надходять на заводи, що виробляють антибіотики, де використовуються як вихідний посівний матеріал.