Производство лечебно-профилактических сывороток и иммуноглобулинов
Очистка и концентрация сывороток
Технологическую схему очистки и концентрации антитоксических сывороток с помощью ферментолиза создал авторский коллектив во главе с А. В. Бейлинсон. Были предложены последовательно 3 схемы очистки антитоксических сывороток, включающих ферментолиз, термоденатурацию балластных белков и диализ -- Диаферм. Последняя модификация метода Диаферм-3 ИЭМ АМН СССР широко применяется во всех сывороточных производствах нашей страны. При очистке этим методом ферментация белков сыворотки ведется 2 часа при температуре 23° и pH среды 3,2 и 4,2 высокоактивным ферментом.
Балластные вещества удаляются с осадком при pH 4,3 прогреванием ферментированных сывороток 45 минут при 58° в присутствии 14%-сернокислого аммония.
Ферментированный иммунный глобулин выделяется из фильтрата при pH 7,0--7,1 дополнительным высаливанием сернокислым аммонием из расчета 200 г на 1 л фильтрата. Выпавший при этих условиях осадок иммунного глобулина отфильтровывается, прессуется и подвергается диализу проточной водопроводной водой.
Для последующей очистки ферментированных белков в сыворотку добавляют хлороформ и соляную кислоту до pH 5,0--5,3.
Еще в 1945 г. А. В. Бейлинсон с соавт. отметила, что сыворотки, полученные после обработки пепсином, отличаются значительной вязкостью. Для освобождения от последней авторы применили изоэлектрическое осаждение денатурированных продуктов протеолиза при наличии в среде тонко эмульгированного хлороформа. Добавление в сыворотку после диализа 30% по объему хлороформа и энергичное встряхивание приводит в процессе осторожного и медленного подкисления к получению стабильной эмульсии хлороформа с желатинированными частицами белка, загрязняющего концентрированную сыворотку и сообщающего ей повышенную вязкость. После стояния на холоде эмульсия хлороформа в сыворотке разрушается, а желатинированные белки продолжают прочно удерживать хлороформ, погружаясь вместе с ним на дно, где образуют плотный осадок. Дополнительная очистка демонстративно видна на фореграммах. В сыворотке после диализа содержится 3 фракции белков, находящихся в зоне гамма-, бета-, и альфа-глобулинов. Дополнительная обработка ее хлороформом с последующим изоосаждением при вышеуказанном pH ведет к исчезновению фракции, лежащей в зоне альфа-глобулина, при этом оседает до 65% из противостолбнячной, до 50% -- из противодифтерийной сывороток липопротеидов.
Балластный осадок удаляют центрифугированием или сепарированием, а прозрачную жидкость подщелачивают до pH 7,0, добавляют 0,8% хлористого натрия и подвергают стерилизующей фильтрации. (см табл 2)
|
1 стадия |
||
|
1 |
Сыворотка разводится до 3% белка |
|
|
2 |
Ферментолиз при 23° 1 ч при pH - 3,2; 1 ч при pH - 4,2 |
|
|
3 |
Термоденатурация (добавление 14% (NH4)2SО4 и прогревание при pH 4,3, 58° 45 мин.) |
|
|
4 |
Фильтрация |
|
|
2 стадия |
||
|
1 |
Осадок отбрасывается Высаливание иммунного глобулина: в фильтрат с pH 7,0--7,1 добавляется до 34%-ной концентрации (NH4)2SО4 |
|
|
2 |
Фильтрация |
|
|
3 |
Фильтрат отбрасывается. Осадок иммунного глобулина прессуется |
|
|
4 |
Диализ иммунного глобулина до 0,2% (NH4)2SО4 |
|
|
3 стадия |
||
|
1 |
Освобождение антитоксина от балластного белка хлороформом и подкислением НСl. |
|
|
2 |
Сепарирование |
|
|
3 |
Осадок балластного белка и хлороформ отбрасываются. |
|
|
4 |
Стандартизация раствора антитоксина до 0,85% NaCl и pH 6,8--7,0 |
|
|
5 |
Стерилизующая фильтрация |